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微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書

MicroGel Extraction Kit

目錄號：  K0524

保   存：  室溫

組分說明

                                          Cat.No.                   K0524

                                          KitSize                     50

                                         BufferPG                     50ml

                                         BufferPS                     15ml

                                BufferPW（concentrate）               10ml

                                         BufferEB                     10ml

                                     SpinColumnDS                    50

                                 CollectionTube（2ml）               50

產(chǎn)品簡介

   本試劑盒于從普通或低熔點瓊脂糖凝膠中回收純化微量DNA+#片段，溶膠速度快，并利用硅基質(zhì)膜技術(shù)，以非常小的終洗脫體積（可少至 10 μl），從瓊脂糖凝膠中，快速純化 50bp-50kb 的 DNA+#片段，純化過程有效去除引物、寡核苷酸、酶等雜質(zhì)，從而可獲得高純度、高濃度，完整性好的 DNA，回收率高達(dá) 90%。本試劑盒回收純化的 DNA 可直接用于測序、連接和轉(zhuǎn)化、酶切、標(biāo)記、體外轉(zhuǎn)錄等分子生物學(xué)實驗。

注意事項

1． *次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明在 BufferPW 中加入無水乙醇。

2．使用前請檢查 BufferPG 是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶或者沉淀現(xiàn)象，可在 37℃水浴幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。

3．電泳時使用新的電泳緩沖液，以免影響電泳和回收效果。

4．切膠時，紫外照射時間應(yīng)盡量短，以免對 DNA 造成損傷。

5．回收率與初始 DNA 量和洗脫體積有關(guān)。

6．所有離心步驟均為使用臺式離心機(jī)在室溫下離心。

自備：無水乙醇，異丙醇，離心管  

操作步驟

1． 將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分），放入干凈的離心管（自備）中，稱取重量。

    注意：若膠塊的體積過大，可將膠塊切成碎塊。

2． 向膠塊中加入3倍體積Buffer PG；當(dāng)瓊脂糖凝膠濃度>2%時，建議使用6倍體積Buffer PG（如凝膠重為100mg，其體積可視為100μl，依此類推）。

3． 50℃孵育10分鐘，其間不斷溫和地上下顛倒離心管，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊，可再補(bǔ)加一些BufferPG或繼續(xù)放置幾分鐘，直至膠塊*溶解。

   注意：在膠充分溶解后檢測 pH 值，若 pH 值大于 7.5，可向含有 DNA 的膠溶液中加 10-30 μl 的 3 M 醋酸鈉（pH 5.0）將 pH 值調(diào)到 5-7。

4． 加入1倍膠體積異丙醇，上下顛倒混勻（如凝膠為100mg,則加入100μl異丙醇）。

5． 柱平衡：向已裝入收集管（CollectionTube）中的吸附柱（SpinColumnDS）中加入200 μl Buffer PS，12,000rpm（~13,400×g）離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6． 將步驟4中所得溶液加入到已裝入收集管的吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

   注意：吸附柱容積為700 μl，若樣品體積大于700 μl可分批加入。

7． 吸附柱中加入500 μl Buffer PG，12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

8． 向吸附柱中加入650 μl Buffer PW（使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

    注意：如果純化的DNA是用于鹽敏感的實驗，例如平末端連接實驗或直接測序，建議加入Buffer PW后靜置2-5分鐘再離心。

9．12,000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以*晾干。

   注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)（酶切、PCR等）。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以*晾干吸附材料中殘余的乙醇。

10．將吸附柱放到一個新離心管（自備）中，向吸附膜中間位置懸空滴加10 μl Buffer EB（pH8.5），室溫放置2分鐘。12,000rpm離心1分鐘，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。

    注意：1）洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液，應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍）。

          2）為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回吸附柱中，重復(fù)步驟10。

          3）洗脫體積不應(yīng)小于10 μl，體積過少會影響回收效率。

         4）如果使用TE洗脫，需要考慮其中含有的EDTA是否會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)。

         5）回收大于10 kb的DNA+#片段時，Buffer EB應(yīng)在50℃水浴中預(yù)熱，適當(dāng)延長吸附和洗脫時間，可增加回收效率。

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